Để làm được một tiêu bản vi học thực vật, cần tiến hành theo các bước sau:
Chọn mẫu
- Thường là mẫu tươi hoặc mẫu ngâm trong cồn 70 độ.
- Đối với mẫu vật là lá thì hình dạng lá phải còn nguyên vẹn, chọn những lá không già quá nhưng cũng không non quá (lá bánh tẻ).
- Đối với mẫu vật là cành, thân hoặc rễ cây thì nên chọn những đoạn tương đối thẳng, có đường kính từ 0,1 – 0,5cm.
- Các mẫu khô nên được luộc hay ngâm nước sôi trước khi cắt, thời gian ngâm hay luộc tùy thuộc vào mức độ rắn chắc của mẫu vật.
Phương pháp bóc hoặc cắt mẫu
Phương pháp bóc
Dùng kim mũi mác rạch đứt một đường nông trên bề mặt cần bóc, sau đó bóc lấy 1 lớp tế bào biểu bì của lá cây; đặt tiêu bản lên giữa phiến kính đã nhỏ sẵn 1 giọt dung dịch lên tiêu bản (nước cất hoặc glycerin) rồi đậy lá kính lại (theo phương pháp giọt ép) và quan sát dưới kính hiển vi.
Phương pháp cắt
Cắt trực tiếp
Mẫu được đặt lên một “thớt” (làm bằng vật liệu có độ cứng nhỏ hơn lưỡi dao cạo như gỗ hoặc khoai lang, v.v.), dùng lưỡi dao cạo cắt thành những lát mỏng. Các lát cắt sau đó được ngâm ngay vào đĩa petri đã có sẵn nước cất.
Cắt bằng máy cắt cầm tay (microtom), theo quy trình sau
Chuẩn bị cốt khoai:
- Dùng dao bài gọt một lõi khoai lang hình trụ, dài 2 – 3cm, sao cho vừa khít ống máy cắt.
- Chẻ đôi lõi khoai này theo chiều dọc thành 2 nửa đều nhau.
Cố định mẫu tiêu bản vào cốt khoai:
- Khoét ở cả hai mặt phẳng mới chẻ đôi này, theo chiều dọc, một khe nhỏ theo hình của mẫu tiêu bản cần cắt, sao cho khi ghép hai mảnh khoai này lại thì mẫu cần cắt được giữ chặt.
- Kẹp mẫu cần cắt vào giữa 2 miếng khoai rồi cho vào ống của máy cắt.
Cắt tiêu bản
- Để mặt phẳng của lưỡi dao áp sát với mặt phẳng của máy cắt, nghiêng một góc 450 kéo chéo từ trái sang phải , cắt qua cốt khoai.
- Sau mỗi lần cắt, vặn ốc của máy cắt theo chiều kim đồng hồ để đẩy cốt khoai lên một chút. Mức độ vặn ít hay nhiều sẽ cho lát cắt tiêu bản mỏng hay dầy.
- Dùng kim chổi lông gạt vi phẫu đã cắt ngay vào đĩa petri có sẵn nước cất. Sau đó dùng chổi lông chọn lấy các lát cắt chuyển sang mặt kính đồng hồ đã có sẵn cloramin bão hòa
(Cloramin B) hoặc dung dịch Javen.
Tẩy và nhuộm tiêu bản
Tẩy
- Tẩy mẫu bằng dung dịch Cloramin B trong thời gian ít nhất là 30 phút. Rửa sạch Cloramin 3 lần bằng nước cất. Nếu mẫu chứa nhiều tinh bột có thể ngâm trong dung dịch cloran hydrat trong 30 phút, sau đó rửa sạch.
- Ngâm mẫu trong acid acetic trong 15 phút. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất.
Nhuộm
- Nhuộm màu xanh bằng dung dịch xanh Methylen. Thời gian từ 5-30 giây. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất.
- Nhuộm màu đỏ bằng cách ngâm mẫu vào dung dịch đỏ Carmin khoảng 30 phút. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất.
Lên tiêu bản
Vi phẫu sau khi được nhuộm, được lên kính theo phương pháp giọt ép.
Cách thực hiện như sau:
Nhỏ vào giữa phiến kính 1 giọt chất lỏng được dùng làm môi trường quan sát (nước, glycerin, vv.), dùng kim mũi mác hoặc bút lông đặt vi phẫu cần quan sát vào giọt chất lỏng. Đậy lá kính lại (chú ý không để lẫn bọt khí dưới lá kính).
Có 2 cách đặt lá kính:
- Cách 1: Đặt một cạnh lá kính tỳ vào bề mặt của phiến kính, bên cạnh giọt
chất lỏng. Dùng kim mũi mác đỡ lấy cạnh đối diện rồi hạ từ từ xuống - Cách 2: Nhỏ 1 giọt chất lỏng (cùng loại với chất lỏng trên phiến kính) vào giữa lá kính. Lật ngược lá kính lại rồi hạ từ từ đây lên giọt chất lỏng trên phiến kính. Khi 2 giọt chất lỏng chạm nhau thì bỏ tay ra. Sau khi đậy lá kính, chất lỏng dưới lá kính phải vừa đủ để chiếm toàn bộ diện tích của lá kính, không thừa chảy ra ngoài và cũng không thiếu. Nếu thiếu, dùng một ống hút nhỏ thêm chất lỏng đã dùng để lên kính vào. Nếu thừa, dùng một mảnh giấy lọc để hút đi. Trong một số trường hợp cần phải thay đổi chất lỏng mà không muốn bỏ lá kính ra thì làm như sau: ở một cạnh của lá kính, đặt một miếng giấy lọc để hút chất lỏng đang ở dưới lá kính. ở cạnh đối diện, dùng ống hút cho giọt chất lỏng mới vào thay thế . Khi cho chất lỏng mới vào thì đồng thời hút chất lỏng cũ ra. Chất lỏng mới sẽ thay thế cho chất lỏng cũ dưới lá kính.
Tiêu bản đạt tiêu chuẩn phải mỏng, sáng, sạch, màu xanh và đỏ rõ ràng, chất lỏng dưới lá kính phải vừa đủ, chiếm toàn bộ diện tích lá kính, không chứa bọt khí, có thể quan sát dễ dàng.
